Post atualizado em 25/02/201
O que é o HPLC ?
HPLC significa Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (em inglês, HPLC – High Performance Liquid
Chromatography). Antes do HPLC estar disponível, a análise por CL era feita
pela passagem do eluente (o solvente usado na CL) usando a força da gravidade e,
portanto, exigia várias horas para ser completada. Mesmo as melhorias
posteriores reduziram pouco o tempo de análise. Aqueles sistemas
clássicos/iniciais de CL são chamados de “cromatografia de baixa pressão” ou
“cromatografia em coluna”.
Nos anos 1970, nos EUA, Jim
Waters fundou a Waters Corporation e começou a vender equipamentos para HPLC, o
que promoveu o uso da técnica em áreas de análises práticas. Os sistemas de CL
que a Waters Corporation desenvolveu usavam uma bomba de alta pressão, que
gerava um fluxo rápido de eluente e, assim, resultava em uma melhoria enorme no
tempo de análise. Por analogia com a “cromatografia de baixa pressão”, o novo
tipo foi chamado de “cromatografia líquida de alta pressão”. Por isso,
achava-se que a sigla HPLC significava Cromatografia Líquida de Alta Pressão
(atualmente, no entanto, é consenso chamar de Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência. Outra grande mudança em relação ao tempo de Tswett foi o método de
aquisição de dados. Ao invés de observar as mudanças das camadas a olho nu, um
sistema de detecção foi acoplado à saída do HPLC, registrando em papel.
Componentes do HPLC
Sistemas HPLC típicos consistem do seguinte. Detalhes de cada parte serão dados abaixo.
Componentes do sistema HPLC
(Fonte:https://microbenotes.com/high-performance-liquid-chromatography-hplc/)
Bomba
Nos primeiros estágios do
desenvolvimento do HPLC, a bomba era a parte mais importante do sistema.
Pode-se dizer que o desenvolvimento do HPLC foi um desenvolvimento do sistema
de bomba. Ela fica posicionada na parte mais alta do sistema cromatográfico e gera
um fluxo de eluente do reservatório de solvente para o sistema. No início do
desenvolvimento da CL, um dos requisitos mais importantes do sistema era a
capacidade de gerar alta pressão. Atualmente, no entanto, esse é um requisito
“padrão”, sendo a principal preocupação nos dias de hoje a capacidade de
fornecer uma pressão estável em qualquer condição, a fim de manter um fluxo
controlável e reprodutível, já que uma mudança neste pode influenciar muito a
análise.
A maioria das bombas usadas nos
sistemas atuais de HPLC gera o fluxo pelo movimento de vai-e-vem de um pistão
motorizado (bombas recíprocas). Devido a esse movimento do pistão, são
produzidos “pulsos”. Houve grandes melhorias no sistema para reduzir essa
pulsação, de modo que as bombas mais recentes geram muito menos pulsos que as
antigas. Contudo, as análises mais recentes exigem sensibilidade muito alta
para quantificar pequenas quantidades dos analitos e, portanto, mesmo uma
variação mínima no fluxo pode influenciar a análise. Sendo assim, as bombas
usadas em análises de alta sensibilidade precisam ser altamente precisas.
Injetor
Um injetor é colocado próximo à
bomba. O método mais simples é usar uma seringa e introduzir a amostra no fluxo
de eluente. Como a precisão das análises por HPLC é muito afetada pela
reprodutibilidade da injeção da amostra, o desenho do injetor é um fator
importante. O método mais comum de injeção de amostras baseia-se nos loops de
amostragem. Também é largamente usado o sistema de amostrador automático
(autoinjetor), que permite injeções repetidas em tempos pré-determinados.
Coluna
A separação se dá no interior da
coluna. Portanto, pode-se dizer que ela é o coração do sistema de HPLC. A teoria da coluna cromatográfica não mudou
desde o tempo de Tswett, mas tem havido uma melhoria contínua no
desenvolvimento de colunas. As recentes são, com frequência, preparadas em
cartuchos de aço inox, ao invés das colunas de vidro usadas no experimento de
Tswett. O material de empacotamento normalmente usado é a sílica ou géis
poliméricos, em lugar do carbonato de cálcio utilizado por Tswett.
Como eluente usam-se desde
solventes ácidos a básicos. A maioria dos cartuchos das colunas é feito de aço
inox, pois este é tolerante a uma grande variedade de solventes. Mas para análise
de alguns analitos, tais como biomoléculas e compostos iônicos, o contato com
metal é indesejável; nesses casos, colunas revestidas com poli-(éter-éter
cetona) (PEEK) são utilizadas.
Detector
A separação dos analitos ocorre
dentro da coluna e o detector é usado para observar a separação obtida. A
composição do eluente é constante quando não há um analito presente. Mas ela é
alterada na presença deste. O que o detector faz é medir essas diferenças, que
são monitoradas sob a forma de sinais eletrônicos. Existem diversos tipos de
detectores no mercado; eles serão explicados na Lição 6.
Registrador
A alteração no eluente detectada
pelo detector está sob a forma de um sinal eletrônico e, portanto, não é
visível a nossos olhos. Antigamente, registradores com caneta e papel eram
populares, mas atualmente o processador de dados computadorizado (integrador) é
mais comum. Há vários tipos de processadores de dados; como exemplos, podem ser
citados um sistema simples consistindo de uma impressora incorporada e um
processador de textos, e um processador tipo computador pessoal com monitor,
teclado e impressora. Também há softwares desenvolvidos especificamente para
sistemas de HPLC. Eles permitem não apenas a aquisição de dados, mas também
ajuste de picos, correção de linha de base, cálculo automático de concentração,
determinação de peso molecular, etc.
Os componentes apresentados até
aqui constituem o básico de um sistema de HPLC. Abaixo são descritos alguns
acessórios opcionais.
Degaseificador
O eluente usado no HPLC pode
conter gases invisíveis para nossos olhos, como o oxigênio. Quando isso
acontece, a presença desses gases é detectada como um ruído e provoca
instabilidade na linha de base. Métodos geralmente usados para degaseificação
incluem a difusão (borbulhamento de um gás inerte), uso de aspirador,
destilação e/ou aquecimento e agitação. Porém, esses métodos não são
convenientes e, além disso, quando o solvente permanece por certo tempo (por
ex., durante uma análise longa), o gás volta a se dissolver gradualmente. Um
degaseificador utiliza tubos de membrana polimérica especial para remoção de
gases. Os numerosos poros minúsculos na superfície do tubo de polímero permitem
a passagem do ar, ao mesmo tempo em que evitam a passagem de qualquer líquido
pelos poros. Colocando-se esse tubo em um recipiente sob baixa pressão, cria-se
uma diferença de pressão dentro e fora do tubo (maior pressão dentro). Essa
diferença deixa o gás dissolvido passar pelos poros, removendo-o. Em comparação
com a degaseificação em batelada clássica, o degaseificador pode ser usado
on-line, é mais conveniente e mais eficiente. A maioria dos novos sistemas de
HPLC contêm um degaseificador.
Forno de coluna
A separação no HPLC é,
frequentemente, muito influenciada pela temperatura da coluna. Para se obter
resultados reprodutíveis, é importante manter condições constantes de
temperatura. Além disso, para algumas análises, como as de açúcares e ácidos
orgânicos, melhores resoluções podem ser obtidas em temperaturas elevadas
(50-80oC). Também é importante manter a temperatura estável para se obter
resultados reprodutíveis, mesmo quando a análise é feita em temperatura próxima
à ambiente. É possível que pequenas diferenças de temperatura provoquem
separações diferentes. Por isso, as colunas são, geralmente, mantidas dentro de
um forno (aquecedor de coluna).
Fontes:
http://www.shodex.net/index.php?lang=9&applic=1472
https://microbenotes.com/high-performance-liquid-chromatography-hplc/
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